نانوذرات mRNA: بیدارسازی HIV در سلول‌های CD4+ خفته
در حال حاضر حدود ۳۸ میلیون نفر در جهان به HIV مبتلا هستند. با وجود پیشرفت‌های چشمگیر در درمان آنتی‌رتروویرال (ART)، این روش‌ها نمی‌توانند مخزن ویروسی در سلول‌های استراحت CD4+ را کاملاً حذف کنند. پژوهش‌ها نشان می‌دهند که پروویروس‌ها (proviruses) در حالت سکوت ترانسکریپتومیک باقی می‌مانند و با آغاز دوباره تراکنش، ویروس دوباره تکثیر می‌شود. علاوه بر این، اولین نسل از معکوس‌کننده‌های نهفتگی (LRAs) تاکنون نتوانسته‌اند اندازه مخزن HIV را کاهش دهند. در این مقاله، ما فناوری نانوذرات لیپیدی mRNA (mRNA-LNP) را به‌عنوان پلتفرمی نوآورانه معرفی می‌کنیم. هدف، تحویل mRNA کدکننده پروتئین Tat و سامانه CRISPRa به سلول‌های استراحت CD4+ است تا نهفتگی HIV را با کمترین سمیت و بیشترین اختصاصیت معکوس کند.
چالش‌های فعلی معکوس‌سازی نهفتگی HIV
تحقیقات اولیه نشان دادند که مهارکننده‌های هیستون دی‌استیلاز تنها نقطه آغاز ترانسکریپشن ویروسی را فعال می‌کنند. با این حال، آن‌ها قادر نیستند فرایند امتداد، کامل‌سازی و اسپلایسینگ RNA را پیش ببرند. در نتیجه، ویروس پس از تحریک مجدد سلول بازمی‌گردد. افزون بر این، این ترکیبات غیر‌اختصاصی, عملکرد سلول‌های ایمنی CD8+ و NK را نیز تضعیف می‌کنند. بنابراین، ما به معکوس‌کننده‌هایی نیاز داریم که هم قدرت بیشتری داشته باشند و هم اختصاصی‌تر عمل کنند.
فناوری نانوذرات لیپیدی mRNA: مروری بر پیشرفت‌ها
در چند سال اخیر، نانوذرات لیپیدی توانستند siRNA و mRNA را به بافت‌های مختلف منتقل کنند. به‌عنوان مثال، داروی Onpattro در ۲۰۱۸ برای درمان آمیلوئیدوز تأیید شد و پس از آن واکسن‌های mRNA علیه COVID-19 تولید شدند. علاوه بر این، انتقال CRISPR–Cas9 با LNP در مطالعات بالینی بی‌خطر گزارش شده است. بنابراین، توجه به mRNA-LNP به‌سرعت افزایش یافته تا بتوان از آن در ژن‌درمانی و معکوس‌سازی نهفتگی HIV استفاده کرد.
روش و متدولوژی
در این پژوهش، فرمولاسیون LNP X با ترکیب اجزای SM-102، DSPC، β-سیتوسترول و DMG-PEG2000 در نسبت مولی بهینه ساخته شد. mRNAها با اصلاح پایه‌ای (N¹-متیل‌پسوئودویوریدین) تهیه و در فاز آبی با بافر استات و در فاز ارگانیک با الکل حاوی لیپیدها مخلوط شدند. دستگاه NanoAssemblr Spark جریان‌های آبی و ارگانیک را با نسبت ۱٫۸ به ۱ ادغام کرد تا نانوذرات با نسبت N/P شش به یک شکل بگیرند. کارایی ورود mRNA به سلول‌های استراحت CD4+ بدون نیاز به پیش‌فعال‌سازی، با سنجش بیان ژن گزارشگر mCherry و بررسی بقا از طریق سیتومتری جریان تأیید شد. همچنین، لودینگ mRNAهای کدکننده HIV-Tat و سامانه CRISPRa (dCas9-VP64 همراه با gRNAهای هدف‌دار) در LNP X انجام شد و پس از تحویل به سلول‌های انسان، افزایش انواع RNA ویروسی با روش RT-dPCR اندازه‌گیری گردید.
نتایج کلیدی و تحلیل
تحویل mRNA به CD4+
آزمایش‌ها نشان دادند بیش از ۷۵٪ سلول‌ها mCherry را بیان کردند. در عین حال، هیچ نشانه‌ای از فعال‌سازی (CD25 و CD69) ظاهر نشد.
معکوس‌سازی نهفتگی با Tat-LNP X
پس از تحویل mRNA Tat، تمامی مراحل شروع، امتداد و اسپلایسینگ ترانسکریپشن HIV با شدت بیشتری رخ داد. در نتیجه، میزان RNA ویروسی حتی از تحریک با PMA/ایونومی‌سین نیز فراتر رفت.
فعال‌سازی اختصاصی با CRISPRa-LNP X
همراه کردن dCas9–VP64 با gRNA هدف‌دار LTR باعث شد اختصاصی‌ترین افزایش RNA ویروسی رخ دهد. ضمن این‌که بیان ژن‌های میزبان کمترین تغییر را نشان داد.
این نتایج نشان می‌دهد LNP X می‌تواند mRNA را بدون پیش‌تحریک وارد سلول‌های CD4+ استراحت کند و نهفتگی HIV را با کمترین سمیت معکوس نماید.
جمع‌بندی و نتیجه‌گیری
در یک نگاه، فناوری mRNA-LNP X راهکاری قدرتمند و اختصاصی برای معکوس‌سازی نهفتگی HIV در سلول‌های استراحت CD4+ ارائه می‌دهد که سمیت و فعال‌سازی غیرخواسته سلولی را به حداقل می‌رساند. Tat-LNP X و CRISPRa-LNP X با انتقال کارآمد mRNAها، زنجیره‌های مختلف ترانسکریپشن HIV را فعال کرده و امکان توسعه درمان‌های ترکیبی برای حذف مخزن ویروسی را فراهم می‌سازند. با این حال، مطالعات آینده باید به پایش تک‌سلولی کارایی تحویل، بررسی سم‌شناسی جامع، توزیع زیستی در مدل‌های in vivo و امکان هدف‌گیری گزینشی نانوذرات به سلول‌های T متمرکز شود.
واژه‌نامه و پرسش‌های متداول
واژه‌نامه و توضیح اصطلاحات
نانوذرات لیپیدی (LNP): ساختارهای نانومقیاس که mRNA یا دیگر اسیدهای نوکلئیک را در خود محافظت کرده و به‌طور هدفمند به داخل سلول‌ها منتقل می‌کنند.
Tat (Trans-activator of Transcription): پروتئین HIV که با اتصال به عنصر TAR روی RNA ویروسی، سرعت و راندمان رونویسی را به‌طور چشمگیری افزایش می‌دهد.
CRISPRa: سامانه فعال‌سازی ژن که از یک Cas9 غیرفعال (dCas9) متصل به دامنه‌های فعال‌کننده رونویسی استفاده می‌کند تا بیان ژن هدف را بالا ببرد.
RT-dPCR: روش شمارش دیجیتال RNA که با ترکیب معکوس‌نویسی و PCR دیجیتال، تعداد نسخه‌های RNA را با دقت بسیار بالا اندازه می‌گیرد.
نهفتگی HIV (HIV Latency): وضعیت خاموشی ترانسکریپتومیک ویروس درون سلول‌های CD4+؛ در این حالت پروویروس تحت تأثیر درمان یا پاسخ ایمنی قرار نمی‌گیرد و مخزن ویروسی حفظ می‌شود.
SM-102: لیپید یونی‌شونده‌ای که در فرمولاسیون واکسن‌های mRNA به‌عنوان عامل اصلی تحویل و پایداری لیپیدی به‌کار می‌رود.
β-سیتوسترول: لیپید گیاهی که با بهبود ویژگی‌های ساختاری لایه لیپیدی، کارایی تحویل نانوذرات به سلول را افزایش می‌دهد.
سوالات متداول
به‌طور کلی، LNP X با طراحی ویژه قادر است به سلول‌های سفید خون برسد که نانوذرات چربی معمولی جذب نمی‌کنند، بنابراین احتمال آشکارسازی HIV افزایش می‌یابد.
برای پاسخ به این سؤال، باید مطالعات بیشتری انجام شود؛ آشکارسازی ویروس قدم اول است و احتمالاً نیاز به ترکیب با درمان سلولی یا داروهای کمکی دارد.
برای پاسخ به این سؤال، باید بدانید که mRNA پوشیده در LNP X وارد سلول‌های حاوی مخزن ویروس می‌شود و ویروس پنهان را وادار به ظاهر شدن می‌کند تا سیستم ایمنی آن را هدف قرار دهد.
